Penyediaan bibit tebu dianggap masih mengalami kendala yang disebabkan karena bibit yang dihasilkan membutuhkan waktu yang lama dan jumlah ketersediaan bibitnya terbatas. Alternatif untuk mengatasi permasalahan ini adalah memproduksi bibit tebu melalui kultur jaringan dengan metode thin cell layer. Penelitian dilakukan untuk mengkaji pengaruh pemberian zat pengatur tumbuh (ZPT) 2,4-D dan kinetin pada media tanam melalui metode thin cell layer terhadap pembentukan kalus dan planlet tebu. Eksplan yang digunakan adalah basal tebu in vitro yang ditanam ke media induksi menggunakan media dasar MS (Murashige & Skoog) dengan penambahan ZPT 2,4-D dan Kinetin dan ditanam dengan menggunakan metode thin cell layer. Konsentrasi 2,4-D yang digunakan adalah 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, dan 4 mg/L; konsentrasi kinetin yang digunakan adalah 0 mg/L, 1 mg/L, dan 2 mg/L. Hasil kalus induksi kemudian dipindah ke media proliferasi untuk pertumbuhan kalus yang melalui 4 fase, yaitu fase globular, fase skutelar, fase koleoptil dan fase kotiledon. Kalus yang sudah masuk fase kotiledon kemudian dipindahkan ke media regenerasi untuk membentuk planlet baru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan ZPT dengan kombinasi 2,4-D 3 mg/L + kinetin 0 mg/L (D3K0) pada media kultur memberikan respon terbaik dalam pembentukkan induksi kalus tebu dengan rata-rata persentase tumbuh kalus mencapai 60,00%, sedangkan konsentrasi 2,4-D 3 mg/L + kinetin 1 mg/L (D3K1) adalah konsentrasi yang paling efektif untuk pembentukan planlet tebu dengan rata-rata tumbuh planletnya mencapai sebanyak 14,00 planlet.