Biogas merupakan alternatif sumber energi yang dapat diperbaharui dapat mengurangi kelangkaan kebutuhan energi. Limbah cair industri alkohol (vinasse) berpotensi sebagai salah satu bahan baku biogas. Vinasse mempunyai pH ( 4-5 ) bukan merupakan kondisi yang mendukung metanogen, sehingga diperlukan penelitian untuk mengatur kondisi yang terbaik pada produksi biogas. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh perbandingan vinasse dan air terhadap produksi biogas secara fed batch. Berbagai perbandingan vinasse dan air = 1:2 ( R.1 ) ; 1:2,5 ( R.2 ) ; dan 1:3 ( R.3 ) sebanyak 500 mL diumpankan ke bioreaktor. setiap 3 hari sekali dengan jumlah stater kotoran sapi 6L.. Dilakukan analisis Total Suspended Solid (TSS), Volatile Suspended Solid (VSS) dan Chemical Oxygen Demand (COD) awal. Volume biogas diukur setiap hari. Sedangkan kandungan Total Suspended Solid, Volatile Suspended Solid dan Chemical Oxygen Demand dianalisis setiap 1 minggu sekali. Analisis TSS dan VSS dengan metode APHA 2005 dan COD dengan metode SNI (2009) serta volume biogas dengan manometer air. Hasil penelitian menunjukkan produksi biogas pada R.1 diperoleh akumulasi volume biogas sebesar 1640,949 mL, pada hari ke-9 dengan pH 7 kadar CH4 sebesar 9,895% dan kadar CO2 sebesar 36,930%. Rancangan 2 ( R.2) volume biogas terbesar dihasilkan pada hari ke-20 sebesar 119,669 mL dengan kadar metana sebesar 15,849%, kadar CO2 sebesar 43,282% dan pH 5.Pada rancangan 3 ( R3) volume biogas terbesar dihasilkan pada hari ke-10 sebesar 158,24 mL dengan kadar metana sebesar 35,355%, kadar CO2 sebesar 35,271% dan pH 7. Pengumpanan secara fed batch campuran Vinasse dan air pada produksi biogas setiap 3 hari sekali akan menekan efek inhibitor. Bahan organik yang telah terdegradasi menjadi gas akan selalu ditambahkan sehingga bahan organik yang terdapat di dalam substrat selalu ada. Kondisi ketersediaan substrat yang cukup akan menghasilkan biogas maksimal.